TUBERCULOSIS EN MAMÍFEROS: TIPOS DE RESPUESTA INMUNE, CONSECUENCIAS. DIAGNÓSTICO POR IDRT

LA TUBERCULOSIS EN MAMÍFEROS:
TIPOS DE RESPUESTA INMUNE, CONSECUENCIAS.
DIAGNÓSTICO POR IDRT 

Ángel Tato Jiménez, Veterinario Titular
Doctor en Veterinaria
SOCIVESC

 

 

Para los veterinarios de Salud Pública, investigadores y en general para todos los interesados en la enfermedad tuberculosa en mamíferos, resultan sorprendentes, y a veces inesperados, muchos de los hechos que suceden en el transcurso de esta enfermedad. Los rebaños vacunos presentan inexplicables incrementos de positividad al diagnóstico por IDRT, sin que aparentemente hayan cambiado los factores y circunstancias epidemiológicas (incluidas las condiciones ambientales). Tras varios años de negatividad a la IDRT y sin hallazgos de lesiones compatibles con la enfermedad en animales domésticos o salvajes del entorno, aparecen reaccionantes positivos o hallazgos en las inspecciones postmortem de matadero o de actividades cinegéticas. Por el contrario, animales con reacción negativa a la IDRT, evidencian cuando son sacrificados fuertes y diseminadas lesiones compatibles con TBC. También se detectan humanos infectados con M. bovis que no manifiestan relación con ganados o animales salvajes; ni siquiera con el entorno rural.

En esta revisión bibliográfica se tratarán de poner de manifiesto algunas circunstancias de la inmunopatogenia que pueden indicar el camino por donde se pueden aclarar algunos de los hechos encontrados y que a primera vista resultan sorprendentes.

 

FORMAS DE ENFERMEDAD

Solo una pequeña proporción de individuos infectados desarrolla enfermedad tuberculosa generalizada. En la mayoría de los individuos infectados con M. tuberculosis complex lo que se desarrolla es una infección latente, proceso en el que este microorganismo persiste en dicho estado durante períodos prolongados (Steward et al., 2003). En tales casos, la TBC tiene un período de latencia variable que puede ser muy prolongado (especialmente en los animales de larga vida, como los humanos). Existen, como veremos, diversos mecanismos micobacterianos e inmunológicos que pueden explicar estas TBCs “dormidas” (Parrish et al., 1998). En una proporción relativamente pequeña de individuos de  nuestra especie, la infección puede reactivarse y causar una TBC activa. Es de señalar que en humanos y otros mamíferos vacunados, la BCG no protege contra la TBC pulmonar ni contra la fase latente de la enfermedad (Álvarez et al., 2009).

 

CONTAGIO

Las micobacterias patógenas para mamíferos son excretadas por animales bacilíferos (enfermos, o de forma mas inhabitual, simplemente infectados), en las secreciones respiratorias, heces, leche, a veces en la orina, secreciones vaginales o semen. Las localizaciones que facilitan TBC abiertas (pulmonares, intestinales) son las más bacilíferas. Existen portadores asintomáticos en todas las especies, e incluso sin manifestar Intradermorreacción Tuberculínica (IDRT) positiva, como ocurre en las situaciones de anergia.

M. tuberculosis complex se puede transmitir por inhalación de aerosoles infectados (de especial importancia en bovinos y humanos), por ingestión (importante en jabalíes y terneros), o a través de heridas en la piel, por transmisión sexual, incluida la inseminación artificial, o por vía vertical (TBC congénita). La importancia de estas vías de transmisión varía según las especies susceptibles, pero las mas habituales son la aerógena y la digestiva.

 

Resistencia ambiental

La transmisión indirecta, muy frecuente en entornos de producción animal extensiva, está facilitada por la considerable resistencia ambiental del agente. En concreto, M. bovis puede sobrevivir varios meses en el medio ambiente, particularmente en sitios fríos, oscuros y húmedos. Con temperaturas de 12-24 °C pueden sobrevivir hasta un año, siempre que estén protegidos de la luz solar (que oxida los componentes grasos de su pared bacteriana). Por esta razón en pastos solo sobrevive algunas semanas, así como en aguas y lodazales. No obstante bastan unas horas de supervivencia incluso con exposición solar directa, para una transmisión efectiva entre individuos que acudan a beber a una misma fuente de agua.

En heces, sangre y orina puede permanecer hasta un año a una temperatura de 12 a 14ºC y al resguardo de la luz solar; o solo un mes si las temperaturas son de entre 24 y 43ºC.

PATOGENIA

Una vez que M. tuberculosis complex llega al bronquiolo, o en su caso al órgano linfoide secundario, puede permanecer libre en aquél, siendo presa de los inmunocomplejos y de los factores del complemento (escasos a nivel bronquial), que acabarían con la micobacteria. La endocitación de la micobacteria por el macrófago puede constituir una forma de escape frente a la inmunidad inespecífica. 

La fagocitosis de M. tuberculosis es principalmente llevada a cabo por los macrófagos a través de diversos mecanismos.  La llegada hasta el macrófago de MTBC puede suceder directamente, siendo detectado por los receptores macrofágicos. Pero también puede ser favorecida por el surfactante A (PSA) producido por las células epiteliales alveolares tipo II, que aumentan la interacción entre la micobacteria y el receptor para dicha proteína. La proteína surfactante A y la D son colectinas, como las proteínas transportadoras de manosas (MBP) y el componente C1q del complemento. Todas estas colectinas juegan un papel importante como opsoninas y como activadores del complemento.  La PSA tiene un dominio tipo colágeno y otro tipo lectina, calcio-dependiente, pudiéndose unir a los carbohidratos de la pared micobacteriana y ser reconocidos por los receptores para PSA macrofágicos (Sastry y Ezekowitz, 1993; Ernst, 1998). La proteína de unión a manosa (MBL), que es una colectina calcio-dependiente y una proteína de fase aguda, que se une a moléculas ricas en mananos de la superficie micobacteriana para opsonizarlas (Sastry y Ezekowitz, 1993).

La unión al factor C3 del complemento permite la opsonización de la micobacteria, de modo que hasta que el fragmento b de este factor no contacta con el su receptor específico no se produce la internalización de la micobacteria, momento en que queda protegida de los componentes del plasma o del medio en que se encuentre y por otro lado de la acción de los mecanismos microbicidas inespecíficos del interior del macrófago.

Los patrones de reconocimiento (PRRs) de las micobacterias tuberculosas son reconocidas por las moléculas de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), que poseen las células del sistema inmune y algunas otras. Así los TLRs, de los cuales la conjunción de TLR1/TLR2, reconocen lipoproteínas triacetiladas, lipomanano, lipoarabinomanano, fosfatidil-inositol-manosido; TLR4 lipoproteínas, lipomananos; la conjunción de TLR2/6, pueden reconocer lipopeptidos diacteliados; el TLR9 componentes CpG, del ADN de doble cadena, especialmente en el interior de los fagosomas. Los receptores Scavenger detectan micobacterias noopsonizadas. Los receptores NOD (dominios de oligomerización de nucleótidos), reconocen el muramil-dipéptido. Dentro de los receptores, tipo Lectina C, encontramos los receptores de manosa, los DC-SIGN, para lipoarabinomanano de manosa y la Dectina-1, para los b-glucanos (Medzhitov y cols, 1997; Juarez y Carvajal, 2009).

Formas Patocrónicas

Una vez en el macrófago MTBC puede replicarse, destruir el macrófago y liberar nuevos bacilos, que a su vez serán endocitados por otros macrófagos, produciendo una inflamación en el lugar de infección. Parte de estos macrófagos viajarán hasta el ganglio linfático adyacente, donde se interactúan con linfocitos, lo que da como resultado la activación del macrófago y la estimulación de los linfocitos T (CD4+) (respuesta retardada). Una porción de estos linfocitos T estimulados pierden su receptor de alojamiento (L-selectina homing) en este proceso, con lo que retornan definitivamente a circulación sanguínea, y expresan además el receptor para IL12 (Munk et al., 1996; Taha et al., 1999). Cuando se encuentran con macrófagos parasitados en el foco de infección, estos LT (CD4+) dan lugar a una respuesta inmunológica adaptativa retardada (inmunidad protectora), que o bien puede acabar con el bacilo, o bien permitirle permanecer en una fase de latencia, en la que disminuye su actividad metabólica y por tanto dificulta la respuesta celular inmune, pero no la anula (tolerancia inmunológica). Finalmente, puede haber un período de reactivación (algo que sucede en cerca del 10% de los humanos inmunocompetentes (Álvarez et al., 2009), en un % mucho mayor de individuos que sufren situaciones de inmunocompromiso -Honer y Rusell, 2001), y en un % desconocido de individuos de otras especies). Estas tres formas (respuesta eficaz, latencia y reactivación) pueden ser fases sucesivas.

Podríamos hablar de una cuarta forma, la que corresponde a animales naturalmente resistentes a la infección tuberculosa. Esta resistencia varía con los individuos, aunque hay especies cuyos individuos son más resistentes que los de otras (la oveja es mucho más resistente que la cabra; el perro que el gato). En una escala zoológica, los más sensibles serían los murinos y los más resistentes los équidos, encontrándose suinos, humanos y bovinos en una posición intermedia. No obstante esta resistencia de base, la resistencia individual puede variar a lo largo del tiempo, bien por el contacto repetido con antígenos micobacterianos, o bien por el padecimiento de procesos o situaciones que conllevan déficit del sistema inmune (Síndrome de Inmunodeficiencia Humano Adquirido, IBR y Enfermedad de las Mucosas de los Bovinos, infección por Circovirus Porcino II, etc).

En los animales dotados de mayor “resistencia”, lo habitual es que el macrófago-monocito con alguna micobacteria del CMTB endocitada produzca IL12 (Trinchieri, 2003). La IL12 es captada por el receptor específico para esta citoquina que tienen las células NK.  En respuesta, las NK fabrican elevadas cantidades de IFN-γ que activaría al macrófago, con lo que éste puede acabar con la micobacteria endocitada sin requerir el desarrollo de la respuesta celular retardada. En teoría, este fenómeno podría posibilitar que no quedasen “huellas” del contacto con la micobacteria (no se producirían linfocitos memoria), con lo cual la prueba IDRT debería resultar negativa, aunque sí podría observarse una elevación del IFN-γ. Esto puede ocurrir en el propio lugar de infección (no siendo necesario que los macrófagos viajen hasta el ganglio linfático correspondiente).

En el primero de los casos descritos anteriormente, con una respuesta eficaz, al replicarse el bacilo, puede desarrollarse un complejo primario, completo o incompleto según haya o no adenopatía satélite. En tal caso, la respuesta inmune del hospedador mediada por los linfocitos T helper tipo I (TH1), con la liberación de IL-12, IFN-γ y TNF-α, resulta en la formación del granuloma, un tejido constituido por macrófagos y linfocitos que rodean un área central de necrosis (Fenhalls et al., 2002). Se trata de una fase de reacción a la enfermedad. En el mejor de los casos la respuesta de activación de macrófagos por los linfocitos T helper y la actuación de los Linfocitos efectores (citotóxicos ó CD8+) sobre los macrófagos que siguen exhibiendo antígenos micobacterianos en su superficie, puede acabar con la infección dejando o no rastro detectable de la enfermedad y sin que queden bacilos vivos: tal acción la realizan mediante sus proteínas perforina y granzima (la primera interactúa con la membrana del macrófago y permite el paso de la segunda; las granzimas son proteasas que inducen apoptosis). Tanto si persisten granulomas, como si se han resuelto las lesiones, la prueba IDRT debería resultar positiva, ya que se ha producido respuesta celular; en todo caso los primeros días post-infección, hasta el desarrollo de la inmunidad retardada, corresponderían con una falta de respuesta a la IDRT, y confirmar la infección requeriría de pruebas complementarias: histopatología, γ−IFN, detección microbiológica de las micobacterias. Esta fase de Inmunidad protectora suele durar (aunque es muy variable dependiendo de especies y aún de individuos), una media de 1 mes, decayendo la respuesta TH1, según los casos, en favor de la TH2 y eventualmente apareciendo generalización. Para que se desarrolle el tipo de respuesta TH1 -protectora-, debe haber:

• Un estímulo primario, que depende de la IL12 macrofágica y de la captación por el Receptor del Linfocito T de los antígenos micobacterianos unidos a moléculas del MHC, que son presentados por las células dendríticas (Dcs). Este estímulo primario permite la liberación de IFN-γ y TNF-α
• Un coestímulo por parte de distintas proteínas expresadas en la membrana del macrófago y recepcionadas por sus correspondientes moléculas en la membrana del linfocito T; sin este coestímulo no se produce la activación “suficiente” del macrófago.

Cuando se producen ambos estímulos la duración de la inmunidad protectora puede ser larga, pero variable, lógicamente, según la dosis infectante y la especie animal.

Los animales de resistencia intermedia, por ejemplo los suidos y, mustélidos como los tejones, son deficitarios en receptores para IL12, con lo cual sus NKs están en desventaja respecto a otras especies en la resistencia “natural” a la TBC. Esto explicaría la elevada prevalencia de lesiones TBCs, generalmente restringidas a los nódulos linfáticos de la cabeza de los suidos. Evidentemente la falta de respuesta inespecífica conllevaría a que todos los suidos expuestos a micobacterias tuberculosas desarrollaran lesiones compatibles con la enfermedad.

Sin embargo, la realidad observada no es así:

Una subpoblación de células T, la ϒδ, representa menos del 5% de la población periférica circulante en humanos, (Havlik et al., 1991); constituyendo en suidos desde el 10 hasta el 39% (Binns et al., 1994; Tizard et al., 1998) y en los rumiantes pueden constituir hasta el 60% de la población de células T circulantes (Wyatt et al., 1994). Estas células se expanden rápidamente y producen grandes cantidades de citocinas (IFN-γ, TNF-α, IL-17) y quimiocinas (RANTES, IP-10, linfotactina) ante una estimulación antigénica, pudiendo lisar las células infectadas por micobacterias, mediante granzimas y perforinas; o bien interactuando con otras células, como monocitos, células dendríticas, neutrófilos y células B. Incluso pueden presentar lípidos micobacterianos en el contexto CMH I a linfocitos citotóxicos o unidos a CMH II a linfocitos Helper. La mayoría de células T γδ se activan a través de procesos independientes del MHC; muchas células T γδ también reconocen marcadores de superficie asociados a estrés en células infectadas y tumores gracias a receptores de NKs. Tienden a acumularse en superficies epiteliales y pueden ser una línea de defensa temprana contra la invasión inicial por micobacterias.

En humanos y macacos, pero no en ratones, tanto la infección por M. tuberculosis complex como la vacunación con BCG inducen la expansión de células T ϒδ, que provoca una protección parcial contra la progresión de la TB (Harvlik et al., 1991). Presentan actividad citolítica inespecífica contra células infectadas por micobacterias e interactúan con otros linfocitos como los B. Los T ϒδ en infecciones por micobacterias pueden desarrollar funciones efectoras, incluyendo la secreción de un perfil de citocinas tipo 1 similar a las de las células CD4+ Th1, así como pueden mediar una actividad citolítica contra células blanco: gracias a ella destruyen células con antígenos micobacterianos en su superficie, frente a los que se han producido anticuerpos (ya que las células Tϒδ, han actuado induciendo la formación de anticuerpos IgG1); esos antígenos son reconocidos a través de los receptores Fc que poseen las células NK (actividad célulo mediada dependiente de anticuerpos) (Evans et al., 1993; Raulet y Heid, 1995; Lang et al., 1995).

Estas células pueden ser estimuladas por antígenos no peptídicos fosforilados, ampliando el repertorio de blancos que presenta el patógeno, capaz de estimular una respuesta inmune protectora en el hospedador (Schoel et al., 1994; Constant et al., 1994).

En situaciones de latencia, se puede dar lugar a que, debido a la falta de respuesta adecuada, no se produzca la activación del macrófago ni la respuesta de LT citotóxicos (CD8+), y que, sin embargo, MTBC sea aislado de muestras pulmonares aparentemente sanas (Hernández-Pando et al., 2000), o de otros tejidos. Mientras no exista una respuesta celular consistente, mediada por células TH1, no habrá reacción positiva a la IDRT, o esta será dudosa (dependiendo de diversos factores que comentaremos mas adelante). Se han aislado micobacterias atípicas de ciervos aparentemente sanos, de nódulos linfáticos intestinales y mucosa intestinal (ambas sin lesiones) (Parra et al., 2001).

Por último cabe señalar que el estado de latencia puede revertir a TBC activa, cuando las condiciones sean favorables para la multiplicación del microorganismo: básicamente por deficiencias en el sistema inmune.

Tanto este último estado, de reactivación tuberculosa (generalización tardía), como las situaciones de desbordamiento del sistema inmune tras la primoinfección (generalización precoz), traen como consecuencia el desarrollo de la enfermedad tuberculosa. En el estado de enfermedad se activan tanto los TH1 como los TH2. La activación de los TH2 se debe en un primer momento a que, en vez de IL12, se produce IL10 por parte de la célula dendrítica o del monocito/macrófago. Esta situación permite la persistencia de bacilos tuberculosos en los macrófagos. La actividad de la subpoblación linfocitaria tipo 2 acaba por anular la actividad protectora de la tipo 1. Así, la IL10 inhibe la actividad fagocítica de los macrófagos, a la vez que se estimula a los LBs en una doble vertiente: por un lado para convertirse en células plasmáticas y producir anticuerpos (que no son protectores,  aunque sí son útiles indicadores de enfermedad generalizada); y por otro para actuar como células presentadoras de antígeno (APC) no profesionales. El efecto final es necrotizante, en vez de protector. Este efecto destructivo se ve agravado por la intervención de las NK, que originan una citotoxicidad dependiente de los anticuerpos.

¿Por qué se producen estos estadíos diferentes?

FACTORES EPIDEMIOLÓGICOS Y PATOGÉNICOS DEPENDIENTES DEL HOSPEDADOR.

Factores Genéticos

Hay mucha controversia, especialmente en bovinos, sobre la posible inducción de resistencia por parte de estos factores. En ratones se ha demostrado la existencia del gen que codifica la proteína NRAMP-1, que se expresa en la membrana del lisosoma y que contribuye a que el macrófago impida la replicación de M. bovis. Se han identificado genes homólogos en otras especies (gallina, cerdo, caballo, oveja, bovino, humano, incluso insectos y hasta se ha identificado en M. leprae). Esta proteína podría inhibir el crecimiento micobacteriano, induciría la formación del granuloma, favorecería la producción macrofágica de reactivos intermedios de oxígeno y nitrógeno (ROI y RNI), favorecería la unión de antígenos micobacterianos a moléculas tipo II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), induciría la fusión fagolisosómica y la producción de algunas citoquinas proinflamatorias. En bovinos este gen se localiza en el cromosoma 2, y tiene un tamaño de 16Kb. Presenta polimorfismos debidos tanto a cambios en el número de repeticiones GT en la región 3’ UTR del gen, como del número de guaninas adyacentes al extremo 5' (Goldstein y Pollock, 1997). Parece ser que en bovinos la mayor resistencia está asociada a la existencia de 13 repeticiones GTs en la región SAT del extremo 3', disminuyendo la resistencia a parásitos intracelulares cuanto mayor es el número de repeticiones GT (Adams et al., 1998). El gen NRAMP1 puede ser considerado como un marcador molecular para la selección genética de susceptibilidad a la enfermedad en la cría de cerdos (Ding et al., 2014). Se ha observado in vitro que existe una relación entre la susceptibilidad o resistencia a M. bovis y determinados polimorfismos del gen para la NRAMP-1 (Qureshi et al., 1996). En cerdos un SNP (polimorfismo simple de nucleótidos) en el intrón sexto de este gen se asocia a niveles altos de polimorfonucleares, aumento de la actitividad citotóxica sobre monocitos, y con el peso a los 6 meses de vida (Wu et al., 2008). La proteína NRAMP-1 contiene 12 dominios transmembrana, dos lugares de N-glicosilación y un residuo de transporte (para cationes). La región terminal NH2 de la proteína NRAMP 1 es rica en serina, treonina y prolina. La expresión de esta proteína en cerdos es importante en hígado, bazo y ganglios linfáticos.

Poblaciones celulares implicadas

El papel regulador fundamental, que determina el tipo de respuesta, corresponde a los linfocitos, pero estos a su vez están condicionados por la población celular diana de las micobacterias, los macrófagos. Los monocitos puede originar macrófagos ó células dendríticas (que también son y actúan como macrófagos). En realidad lo que parece ocurrir es que MTBC puede ser endocitado por un macrófago-célula dendrítica o por un macrófago-monocito. En el primero de los casos las células presentan receptores DC-SIGN, especialmente ávidos del ManLam de la pared micobacteriana (Teunis et al., 2002). Otros receptores involucrados son los TLRs referidos anteriormente (Toll-Like Receptors, receptores tipo Toll, del alemán “raro o extravagante”). Como hemos indicado anteriormente existen diversos tipos, que reconocen distintos patrones moleculares micobacterianos.Son proteínas transmembranales cuyo dominio interno es homólogo al dominio de señal del receptor de IL1 (RIL1). El dominio interno se une a una serina kinasa asociada a RIL1. La serina kinasa activa factores de transcripción que finalizan con la liberación de NF-kB de su secuestrador (IK), se traslada al núcleo y comienza la producción de citoquinas proinflamatorias. Son importantes en el reconocimiento inmune de las micobacterias y probablemente el polimorfismo genético a este nivel o en proteínas que intervienen en la señalización posterior, determinen diferencias en la respuesta innata a las micobacterias. Otra proteína, la de diferenciación mieloide (MyD88) une los TLRs (excepto el TLR3 que utiliza exclusivamente el adaptador TRIF y TLR4 que puede utilizar la molécula TRAM) a IRAK , desencadenando una serie de fosforilaziones, que vía NF-kB es esencial para la activación de los macrófagos por M. tuberculosis complex (Oddo et al., 1998; Means et al., 1999). Existe interferencia entre los reconocimientos micobacterianos debidos a TLR2 y 9: los agonistas micobacterianos de TLR2 suprimen la capacidad de los agonistas de TLR9 para inducir la producción de IFNs tipo I (); esto trae como consecuencia la supresión del procesamiento de antígenos en el contexto MHC I (dismininución o abolición del efecto citotóxico debido a CD8+).

Los TLRs de los macrófagos/monocitos están en desventaja respecto a los DC-SIGN de las células dendríticas en cuanto a su avidez por los componentes de la pared micobacteriana de tipo ManLam. Además los TLRs que presentan las células dendríticas sufren la interferencia de la estimulación originada por el receptor DC-SIGN (Teunis et al., 2002). Este fenómeno causa la producción de IL-10 y otras interleucinas antiinflamatorias, que permiten la supervivencia de la micobacteria, por tanto no se produce una respuesta protectora ni una activación del macrófago. Sin embargo, si existiese primacía de la ruta derivada de los TLRs se originarían linfocinas proinflamatorias (IL-12, IFN-γ TNF-), dando lugar a la respuesta celular, activación del macrófago y destrucción de las micobacterias, o aislamiento de las mismas mediante formación de granulomas. Alternativamente ante un desbordamiento del sistema inmune, puede originarse la generalización precoz. Esto se ha demostrado bloqueando las rutas de producción de la IL10: mediante sustancias que bloquean los receptores para DC-SIGN ó interfieren directamente en la internalización de la señal (generalmente antitumorales).

El papel del macrófago y su diferenciación tienen gran importancia en la infección TBC. Las células dentríticas que tienen interés en la patogenia e inmunidad de la TBC son las mieloides (CD11c+ CD123-), que según el tejido donde se encuentren reciben distintas denominaciones: células de Langerhans (en epidermis y mucosas), células dentríticas dérmicas, células dentríticas tímicas, células dentríticas intersticiales (en casi la totalidad de órganos). Las citoquinas son el elemento estimulante crítico para que los monocitos progresen hacia cada una de sus alternativas de diferenciación (Sierra, 2010).

Las principales citoquinas que determinan la supervivencia, diferenciación y quimiotaxis de los macrófagos son factor estimulante de colonias granulocito/macrófago (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) e IL-3 (Barreda et al., 2004; Zou et al., 2000). En experimentos in vitro para la obtención de macrófagos/células dendríticas, se utilizan GM-CSF e IL4 conjuntamente (Sallusto y Lanzavecchia, 1998); en ausencia de IL-4, tanto el GM-CSF como el M-CSF, originarían macrófagos (Rougier et al., 2002).

En su Tesis Doctoral de 2010, Sierra refiere que el factor de transcripción PU.1 junto con los C/EBPα, RUNX1 y AP-1, son críticos en la diferenciación monocítica, ya que ratones deficientes en PU.1 carecen de linaje mielomonocítico.  Esto se debe a que PU.1 tiene un papel esencial en la regulación de los genes que codifican los receptores de GM-CSF, M-CSF y G-CSF.

GM-CSF es producido por diferentes tipos celulares, incluyendo linfocitos T y B, macrófagos, mastocitos, eosinófilos, neutrófilos y células endoteliales (Barreda et al., 2004); su nivel en sangre en humanos sanos es de 20-100 πg/ml. (Sierra. 2010); sus actividades dependen de la concentración (Conti y Gessani, 2008): M-CSF aumenta la generación de macrófagos en presencia de bajos niveles de GM-CSF, mientras que altas concentraciones de esta última impiden el desarrollo de macrófagos mediado por el M-CSF (Caracciolo et al., 1987). El GM-CSF genera macrófagos que como respuesta a las micobacterias producen IL-23, IL-12, IL-1β , IL-6, TNFα (Verreck et al., 2004-06). Sin embargo los macrófagos inducidos por M-CSF secretan IL10 (con lo que inducen tolerancia) (Verreck, 2004; Li et al., 2005). Los macrófagos resultantes de la acción de cualquiera de las dos citoquinas expresan TLRs 2 y 4. En ambos  es baja la expresión de DC-SIGN, pero se expresa más en los macrófagos inducidos por M-CSF (Verreck, 2006).

Paralelamente hay que señalar que los macrófagos/Células Dendríticas (macrófagos-CD) también actúan como células presentadoras del antígeno (APC), siendo las APC más eficaces en la activación de linfocitos T virgenes (naive) (hecho que los diferencia de los macrófagos/monocitos). Los receptores inducen la endocitación de las micobacterias, las procesan y presentan sus antígenos en su superficie a los linfocitos. La presentación de estos antígenos  se realiza uniéndolos a moléculas del MHC en la membrana celular: del MHC I (para los LT citotóxicos) ó del MHC II (para los LT helper). De este modo migran hacia los órganos linfoides secundarios, donde interaccionan con los LT correspondientes, dando lugar a la respuesta adaptativa. La señal primaria para la estimulación de linfocitos debida a la presentación de antígenos micobacterianos en la superficie de las DCs unidos a moléculas MHCII (que son especialmente abundantes en las DCs), necesita de una señal de coestimulación. Si esta señal fallase o fuese “incorrecta”, se generaría un fenómeno de tolerancia inmunológica (Reis y Sousa, 2006). Para esta coestimulación, el macrófago-CD cuenta en su superficie con moléculas de la familia B7 (Orabona et al., 2004), que interactúan con los ligandos correspondientes (llamados CD28) del linfocito (T helper y/o T efector), y completan la estimulación del linfocito. A raíz de esta estimulación, el LT produciría interleucinas proinflamatorias y activaría al macrófago. En cambio si el ligando linfocitario que se conjuga es el CTLA4, no resulta estimulado el linfocito y consecuentemente no se activa el macrófago generańdose tolerancia ó anergia (Ma y Clark, 2009). Existen más miembros del grupo de receptores linfocitarios para proteínas del grupo B7, como el coestimulador inducible (ICOS) (Hutlof et al., 1999).

Otra molécula de activación temprana es la SLAM (Molécula Linfocitaria Activadora de Señales), que se expresa en linfocitos TH1, TH2 e inmaduros (Cocks et al., 1999), CDs (Bleharski et al., 2001) y monocitos activados (Minagawa et al., 2001). SLAM induce perfiles de citoquinas Th1/Th0 en células T activadas por antígenos (Minagawa et al., 2001). En esta segunda señal de estimulación también intervienen ligandos macrofágicos del grupo TFN (factor de necrosis tumoral), que se conjugan con sus correspondientes receptores linfocitarios (Ma y Clark, 2009). Por último se requiere el concurso de las moléculas de adhesión intercelular del macrófago-DC (CD58 (LFA-3) y CD54 (ICAM-I) y sus correspondientes receptores linfocitarios (LFA-2 y LFA-1) (Romero-Palomo et al., 2011). Es decir, diferentes proteínas de señalización, activadoras (SLAM, ICOS) o inhibidoras (SAP, CD31) participan en la respuesta inmune del huésped contra M. tuberculosis complex, una vez la micobacteria ha sido endocitada por el macrófago.

Las DCs determinan el tipo de respuesta (Kubach et al., 2005) produciendo citoquinas en el microambiente celular (IFN-γ, IL-17) que en último término determinarán la contención de la infección en el complejo primario (TBC latente o dormida) o el desarrollo de enfermedad TBC. Por su parte, los macrófagos-monocitos podrían acabar con la infección (resistencia), aunque ello dependería de la dosis infectiva y del estado de salud del animal. No obstante, se debe tener en cuenta que aún no siendo la adecuada para controlar la tuberculosis, la respuesta TH2 no solo es necesaria, sino fundamental a la hora de acabar con los patógenos extracelulares.

Por otro lado una posible acción de los linfocitos reguladores o supresores (LTreg) (CD4+ CD25+ Foxp3+) es suprimir la proliferación y estimulación de linfocitos TCD4+(LT helper), linfocitos TCD8+(LT efectores), linfocitos NK, células dendríticas, monocitos/macrófagos, linfocitos B y células NKT (Kim 2006; Ziegler 2006), ya que su propagación sin fin podría originar grandes daños tisulares (tuberculosis miliar –generalización precoz rápida). En la diferenciación de estos LTreg a partir de CD4+ parece jugar un papel importante el factor transformador del crecimiento beta (TGF-β) junto con la IL2 y el ácido retinoico, que determinan la expresión en los CD4+ del factor de transcripción Foxp3 (Forkhead box P3) (Chen et al., 2003; Glimher y Murphy, 2000, Kang et al., 2007, Zhu y Paul, 2008, Locksley, 2009). Una vez activados, estos LTreg secretan IL10 y TGF-β, y  galectina-1, que induce apoptosis en los LT (Garin y col., 2007). La fagocitosis de linfocitos apoptóticos puede activar la producción de TGF-β en células dendríticas y macrófagos, lo que conduce a la supresión de la respuesta inmune (Perruche y col., 2008). Los LTreg pueden inhibir la maduración de las Células Dendríticas a través de Lag-3 (CD223), una molécula homóloga a CD4 y que, como ésta, se une con alta afinidad a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de tipo dos (MHCII), expresadas en Células Dendríticas inmaduras, induciendo señales de inhibición que suprimen su maduración y por lo tanto, su capacidad inmunoestimuladora (Liang y col., 2008). Otros mecanismos de actuación de estos LTreg son la IDO (indolamina di-oxigenasa), que regula mecanismos proapoptóticos, mediante la interacción del CTLA4 de los linfocitos efectores (Mellor and Munn 2004). También pueden actuar mediante mecanismos dependientes de la expresión de las enzimas CD39 y CD73 que generan adenosina extracelular que suprime la función de los linfocitos T efectores, a través de la activación del receptor de adenosina 2A (A2AR) (Borsellino y col., 2007). En consecuencia los LTreg pueden favorecer la supervivencia de CMTB.

Las señales de activación procedentes de los receptores de las células dendríticas (coactivación de la ruta del DC-SIGN y del TLR4, con la acetilación correspondiente de la unidad transcriptora p65 del NF-B y la consecuente falta de inducción de linfocinas proinflamatorias), harían prevalecer la IL10 (Gringhuis et al., 2007), junto con la excitación del CTLA4 y con una inadecuada señal secundaria de coestimulación para los linfocitos T, acabarían favoreciendo la mayor expresión de las interleucinas antiinflamatorias (TH2), lo que se traduciría en una situación de anergia, por lo que la prueba IDRT podría resultar negativa (falsamente negativa), o dudosa (dificultando el diagnóstico diferencial con infecciones por micobacterias atípicas, e incluso con otros agentes noxantes que desencadenen inmunidad mediada por células).

Se cuestiona si la respuesta celular retardada puede correlacionarse o no con la protección. En todo caso da lugar (hasta que se produzca la anergia) a una respuesta positiva a la IDRT, ya que hay actuación de LT helper y se forman linfocitos memoria. La respuesta celular retardada comprende una serie de sucesos inmunes que se producen secuencialmente en los primeros cuatro días tras la infección micobacteriana: entre las 6 y 12 horas postinfección hay un predominio de la respuesta TH2 (Comstock, 1994) (antiinflamatoria/no protectora); después y hasta las 24 horas hay un predominio de sucesos inflamatorios, promovidos por las interleucinas de los TH1; a las 48-96 horas puede establecerse una respuesta mixta TH1/TH2, que se asocia con enfermedad (puede originar IDRT negativo o dudoso), o mantenerse el predominio de la TH1, que indica resistencia y daría IDRT positivo.

 

Factores Medioambientales.

Existen factores “ambientales” referidos a la exposición a micobacterias atípicas. Según experimentos llevados a cabo en ratones con distintas dosis de M. vaccae (Hernández Pando et al., 2004), cuanto mayor sea la exposición, es mas posible que se desarrolle una respuesta TH2 en el animal, que lo hace susceptible a la infección y generalización TBC; mientras que contactos a baja dosis con micobacterias ambientales no tuberculosas, facilitarían el asiento de una respuesta TH1, protectiva frente a la TBC.

Tolerancia y Anergia: Bases fisiopatológicas

Muchas veces se encuentran animales que dan resultados negativo a la IDRT, y cuando llegan al matadero se observan lesiones compatibles con TBC en ellos, demostrando la presencia de bacilos tuberculosos por técnicas microbiológicas. Otros animales son portadores de bacilos sin mostrar lesiones compatibles, es decir su sistema inmune no reacciona contra bacilos del CMTB. Es conocido que determinadas infecciones víricas y parasitarias deprimen el sistema inmune, modificando o anulando la respuesta a los bacilos tuberculosos. A continuación se detallan algunas causas posibles para estos fenómenos.

Por un lado, una activación repetida y prolongada de los TLRs, debido a la exposición contínua o muy repetida a las micobacterias tuberculosas (pero también a micobacterias atípicas, otras bacterias, parásitos y/o virus, etc)  puede inducir hiporreactividad o hiporrespuesta en la cascada molecular que se origina con la activación del TLR dado (Medveder et al., 2006). El final de la vía iniciada con la estimulación del TLR es la liberación del transcriptor NF-B (que una vez libre se desplazaría al núcleo e iniciaría la transcripción de citoquinas proiinflamatorias. Dicho transcriptor se encuentra inhibido en el citoplasma por IB. Una proteína de esta última familia, la Bcl-3, estabilizaría la unión del componente p50 del NF-B a la región promotora de la citoquina inflamatoria TNF- evitando así la unión a esta región del dímero transcripcionalmente activo p65 –también miembro del complejo NF-B (Ruadhiri et al, 2007).

Por otro lado la respuesta inmunitaria requiere de un buen estado nutricional del individuo (que puede ser perturbado por la presencia de parásitos). La falta de proteínas y de calorías suficientes dificulta la función del sistema inmune, pues el cuerpo utiliza las proteínas de que dispone para funciones vitales en el encéfalo, corazón, riñones e hígado; originando cambios en el timo y en los órganos linfoides secundarios (Keusch, 1993): el timo sufre una involución, con marcado descenso del número de linfocitos en su zona cortical; así como disminución de las hormonas timulina, timopoyetina y timosina. Los tejidos linfoides periféricos (bazo, tonsilas, nódulos linfáticos, placas de Peyer y MALT, muestran marcada atrofia, con depleción de LTs. A la vez disminuye el número de LTs CD4+ circulantes, mientras se mantiene el de CD8* (este cociente, unido al incremento de LTs inmaduros circulantes sirve como marcador de carencia/suficiencia de proteínas) (Woodward y Miller, 1991). Los déficits de proteínas y calorías en dieta en humanos y otros animales afectados de TBC, dan lugar a falta de linfoproliferación, debida a la carencia que se origina en IL-2 (principal factor de desarrollo de LTs (Cohen et al., 1987; McMurray y Mintzer, 1989). Las células depresoras también contribuyen a la depleción de la actividad linfoproliferativa. La falta de proteínas da lugar a la incapacidad para la generación y  el mantenimiento de células memoria, durante la respuesta primaria. Esto ocurre por la dificultad de interacción de los linfocitos en individuos con pobreza proteica y por la alteración que causa esta insuficiencia en la circulación de LTs (que no pierden su homing) hasta el lugar de infección (Bartow y McMurray, 1990; Mainaly y McMurray, 1998). La falta de circulación de linfocitos ha sido descrita en enfermos incontrolados de TBC (Rook et al., 1976), especialmente en  individuos con falta de proteínas, debido a las alteraciones en la producción de quimiocinas y moléculas de adhesión, tanto las expresadas por los propios LTs, como las que se expresan en los endotelios. Cuando existe déficit de proteínas se produce una disminución de IFN- (Keusch et al., 1983) al haber escasez de sus células productoras (LT helper y NK (Ingram et al., 1995); igualmente habrá déficit de IL-2, de la cual también depende indirectamente la producción de IFN- (ya que esta IL-2, induce la producción y proliferación de LTs). Paralelamente se ha visto que la falta de proteínas induce el incremento de la producción de TGF- en cobayos tuberculosos por parte de sus macrófagos peritoneales; en consecuencia se produce una depresión de la respuesta proliferativa a la PPD de los PBMCs  (Dai et al, 1998)

En todo caso las dietas deficientes en proteínas, calorías, zinc y Vit D se asocian con defectos en la respuesta antígeno-específica de LTs, in vivo e in vitro, en cobayos infectados con micobacterias tuberculosas; mientras que una dieta que solo sea deficiente en proteínas originará en ellos solamente una menor resistencia a la TBC, tras la vacunación con BCG.

Es resaltable, que mientras en los estadíos iniciales de la enfermedad TBC en ratones mal nutridos, existe reducida expresión de IFN-, TFN- e iNOS, en los pulmones de aquéllos la reacción granulomatosa es inadecuada, permaneciendo así durante todo el curso de la enfermedad. El efecto diferencial entre animales con deficiencias de proteínas y de calorías y de animales con alimentación normal es patente, indicando que los estados de nutrición deficientes afectan marcadamente la respuesta célulomediada.

El déficit de vitamina D origina disminución de la respuesta inmune (Risco et al, 2016). La interacción de la 1,25-(OH)2-vitamina D con el VDR desencadena la formación de heterodímeros con el receptor RXR de retinoides, que se unen con el ADN para dar lugar a la regulación de la transcripción de más de 200 proteínas involucradas no sólo en el metabolismo del calcio, sino también en la proliferación y diferenciación celular y en la función inmunitaria, incluyendo la modulación de la respuesta inmune a través de la interacción con el receptor específico que se expresa constitutivamente en células presentadoras de antígenos (CPA) como células dendríticas (CD) y macrófagos y en linfocitos T (Deluca et al., 2001; Lin y White, 2004). La Vit D actúa contra la micobacteria mediante la inducción de péptidos antimicrobianos, como la proteína proinflamatoria LL37, -defensina 4-Coronina 1 y catelicidina (Liu et al., 2007). Este péptido tiene también capacidad para modular la respuesta inflamatoria y la quimioatracción de células inmunes (Alalwani et al., 2010). Una concentración adecuada de 25-(OH)-vitamina D puede precipitar la producción de variantes específicas de estos péptidos contra las formas intracelulares de Complejo Mycobacterium tuberculosis en los macrófagos inducidos por la interleuquina 15. Esta citoquina, además de promover la diferenciación y activación de los linfocitos, puede activar a los monocitos y macrófagos. En consecuencia la Vit D puede ayudar a contener el crecimiento de las micobacterias, en jabalíes y ciervos (Risco et al., 2016). Sin embargo es necesario considerar que no solo los niveles séricos de Vit D podrían influir en la propensión y desarrollo de la TBC, sino también el efecto de la variabilidad genética en las poblaciones: entre otros, mutgen, nramp y gen del RVD (mediador entre la concentración de la molécula y sus efectos celulares), que media la unión de los PAMPs micobacterianos a los TLRs 2/1L (Hernández-Sánchez et al., 2011). Mientras que M. tuberculosis puede sobrevivir en las células dendríticas estimuladas por el TLR2/1L, los bacilos son destruidos en los macrófagos estimulados por esta interleucina 1L. En coincidencia, en un metanálisis se ha señalado que la reducción de los niveles circulantes de vitamina D se vincula con un mayor riesgo de tuberculosis activa. Está demostrado que el calcitriol es capaz de actuar sinérgicamente con IFN- para contener la replicación intracelular de M. avium y M. tuberculosis en cultivos de monocitos/macrófagos humanos (Denis, 1991; Rook et al., 1986, 87). Sin embargo no muestra este mismo efecto en macrófagos murinos (Bar-shavit et al., 1981). La deficiencia de Vit. D en la dieta acarrea falta de respuesta al PPD en cobayos (Hernández-Frontera y McMurray, 1993; McMurray et al., 1990) por falta de capacidad de estimulación de la proliferación de LTs

Chan et al., 1996, sugieren que una dieta adecuada tendría un impacto positivo en las defensas del individuo frente a infecciones.

 

 

FACTORES MICOBACTERIANOS QUE FAVORECEN LA PERSISTENCIA DE LA MICOBACTERIA EN EL MACRÓFAGO.

Las micobacterias son capaces de suprimir la respuesta inmune celular (Teunis et al., 2002). Se ha observado que los receptores para manosa de las DCs (CD11b, y CD11c -DC-SIGN), son los principales receptores para las micobacterias (Schlesinger, 1993-94), y de su interacción resulta la producción de IL10-tolerancia inmunitaria, lo que permite a MTBC  permanecer “dormidos” en el macrófago. Esta situación, sin embargo, no sucede con micobacterias atípicas (como el M. smegmatis, ya que el lipoarabinomanano de su ManLam, no está metilado, por lo que no puede unirse al receptor celular DC-SIGN) (Chatterjee y Khoo 1998). El LAM puede ser secretado por las micobacterias en los endosomas fagocíticos, uniéndose a la lectina DC-SIGN, y promoviendo así la producción de IL10 (Chatterjee y Khoo 1998; Russell, 1994; Sturgill-Koszycki et al., 1994). La producción de IL10 aumenta considerablemente cuando además de ManLam se utiliza LPS (Teunis et al., 2002). Por contra, la utilización de anticuerpos anti DC-SIGN disminuye la internalización de M. bovis BCG en las Células Dendríticas (Teunis et al., 2002). Engering et al. (2002) demuestran que la unión de ligandos solubles o anticuerpos anti DC-SIGN determina la internalización del complejo de DC-SIGN-ligandos hasta los endosomas/lisosomas, lo que trae como resultado la baja expresión de DC-SIGN en la superficie del macrófago.

El ambiente hipóxico del interior del granuloma obliga a MTBC a reducir al máximo su replicación. El granuloma, al igual que sucede en los tumores, está aislado del resto del organismo animal, de modo que las condiciones inmunes interiores pueden ser distintas (y generalmente lo son) a las del resto del individuo: en el granuloma puede existir un predominio de respuesta TH2 y en su exterior una TH1 (esta situación es particularmente evidente en los cánceres (Sierra, 2010). Esta situación de aislamiento además permite que en el granuloma se produzcan focos de necrosis, con ambiente de anaerobiosis, que favorecen la pervivencia de M. tuberculosis complex en espacios extracelulares (Álvarez et al., 2009) (no expuestos a la acción de los componentes del complemento ni a inmunocomplejos). El αTFN contribuye al aislamiento del granuloma y con éste del MTBC. Aunque localmente destructiva, la respuesta necrotizante puede conducir a una fibrosis de las lesiones tuberculosas, a la necrosis de tipo caseoso y a la desestabilización de la membrana mitocondrial (MPT), que acarrea muerte celular acelerada con la desintegración de la membrana plasmática; se ha comprobado que, para ello, algunas cepas patógenas del M. tuberculosis complex, pueden incrementar la avidez por la prostaglandina E2 de su receptor específico (Chen et al., 2008). PGE-2 tiene un efecto inmunosupresor importante que incluye la disminución de la proliferación de los linfocitos, e inhibición de la activación de las células NK y de la expresión de las móleculas de tipo II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-II) (31, 32). También se ha encontrado que la PGE-2 inhibe la producción de las citocinas Th1 (INF, IL-2, IL-12), bloquea la activación de los macrófagos y suprime la producción de la IL-1 y el TNF (Betz, y Fox, 1991; Kuroda et al., 2000). En estudios en ratón se ha observado que los macrófagos alveolares producen grandes cantidades de PGE2, que a dosis altas inhibe la formación de INOS por el macrófago (Milano et al., 1995).

M. tuberculosis complex puede experimentar cambios en la composición de su pared celular, variaciones que influyen en el establecimiento del estado de latencia de este microorganismo: el Ziehl-Neelsen puede resultar negativo, aún con una TBC activa (Seiler et al., 2003), pero generalmente la tinción fluorescente de rodamina/auramina es positiva. Estras variaciones son consecuencia de la pérdida o reordenación de distintos componentes de la pared micobacteriana (Álvarez, 2009).

La expresión diferencial de algunos genes reguladores puede ser determinante en la supervivencia de M. tuberculosis complex dentro del animal. Así la respuesta inicial de M. tuberculosis a la hipoxia se regula por dos componentes del regulón dosR, también llamados devR, Rv3133c (Park et al., 2003). La fosforilación de dosR, por cualesquiera de los dos sensores de histidina-kinasa, dosS o dosT, conduce a la inducción de 50 genes (Roberts et al., 2004). La expresión del regulón Dos se induce también en respuesta a los intermediarios reactivos de nitrógeno (RNI) por los macrófagos infectados de ratones y cobayas (Sharma et al., 2006). El ambiente anaerobio del interior del granuloma, induce a M. tuberculosis a la expresión de 9 genes, algunos de los cuales están reprimidos durante la aerobiosis (narG, cysH, nirA, fdhF, nuoA/D/J/L y glpD2) (Hampshire et al., 2004). Otro grupo de genes (homólogos de la isocitrato liasa -aceA- o isocitrato deshidrogenasa -icd-, además de los que codifican las proteínas involucradas en la respiración aerobia/anaerobia) pueden expresarse o sobreexpresarse en determinadas condiciones de necesidad, como estrés, hipoxia, carencia de nutrientes, exposición a los RNI y otros factores del interior del macrófago (Schnappinger et al., 2003; Talaat et al., 2007). Se ha observado que el incremento de isocitrato liasa, tras la endocitación macrofágica, permite a M tuberculosis realizar β-oxidación de los ácidos grasos, lo que permite su superviviencia (McKinney et al., 2000). El principal factor sigma de M. bovis, RpoV, ha demostrado conferir virulencia a una cepa atenuada de esta micobacteria del complejo tuberculosis (Gómez et al., 1998). Otros factores sigma del M. tuberculosis complex, sigB, sigE y sigH, modifican la expresión de un subgrupo de genes necesarios para la adaptación al estrés (Manganelli et al., 2002).

Durante estos estados de latencia M. tuberculosis complex permanece genéticamente competente, (pudiendo replicarse cuando las condiciones ambientales se lo permitan), ya que el gen rpoA (implicado en el funcionamiento de la ARN polimerasa) permanece activo (HU et al., 2000).

Se han identificado determinadas proteínas, que permiten a la micobacteria almacenar nutrientes, susceptibles de ser utilizados en momentos de precariedad para ella, como la enzima rel (Primm et al., 2000). La proteína acr parece sobrexpresarse en condiciones de hipoxia (Yuan et al., 1996-98).

DIAGNÓSTICO DE LA TBC EN ANIMALES POR IDRT

Las intradermorreacciones consisten en la aplicación intradérmica de una sustancia conocida con la finalidad de evaluar la hipersensibilidad retardada (HSR). Se utilizan con fines diagnósticos y pronósticos. Se trata de una reacción inflamatoria mediada por linfocitos T CD4+. Aparece 48 a 96 horas tras la exposición al antígeno. Está dirigida contra patógenos intracelulares como las micobacterias, aunque también contra otros parásitos intracelulares y algunos hongos. También es responsable de la respuesta antitumoral (Hinshaw, 2005).

Antes de proceder a la tuberculinización debe medirse la piel del lugar de inoculación y hacer una exploración del animal, observando el estado general, la posible presencia de hipodermosis y otras alteraciones de la piel, especialmente cercanas a la zona de inoculación.

La lectura deberá hacerse a las 72 horas, pudiendo demorarse hasta las 96. Debe explorarse el animal, el área de la inoculación, los ganglios correspondientes (retrofaríngeos, submandibulares y preescapulares, así como los signos de inflamación del lugar de inoculación y de los ganglios explorados; y finalmente medir con cutímetro el engrosamiento. Debería quedar constancia de toda reacción observada (dolor, calor, tumor, color (en pieles claras), especialmente el engrosamiento (tumor).

La Sensibilidad de la IDRT en la región de tablas del cuello, se considera la más adecuada para la interpretación de la prueba en los bovinos (Radostist et al., 1998) y es la indicada según la normativa vigente en España.

PRUEBA CERVICAL COMPARATIVA CON PPD AVIAR

Permite distinguir la reacción debida a M. tuberculosis complex, fundamentalmente a M. bovis y la debida a micobacterias atípicas e incluso otros actinomicetos (Roswurm y Konhya, 1973; Roswurm et al., 1979)

BASES FISIOPATOLÓGICAS DE LA IDRT:

Cuando se tuberculiniza a un animal sensibilizado, el antígeno incoculado se une a moléculas de clase II del CMH, para ser presentado a los linfocitos memoria (CD45RO), que lo reconocen. La respuesta al PPD ocasiona la liberación de IL2 y γIFN, por parte de las poblaciones de de células CD4+ y tal vez de linfocitos Tγ/δ, siempre y cuando no exista una respuesta TH2 preponderante (Honda y Oizumi, 1998). En el lugar de inoculación, estas linfocinas atraen y activan macrófagos circulantes y tisulares, que fagocitan a los antígenos. Se activan también los linfocitos efectores (citotóxicos DC8+), los cuales destruyen los macrófagos que exhiben en su superficie antígenos micobacterianos de procedencia endosplámica y procesados en el seno de la clase I del MHC; otra subpoblación de células, hoy conocida como Treg (Stahl et al., 2010) modulan la reacción mediante sus linfocinas; a lo que se añade el agotamiento por destrucción de todo el antígeno inoculado (Ernst et al., 1990).

La reacción de hipersensibilidad a la tuberculina se acompaña de un área de induración y tumefacción en el lugar de su inoculación. En individuos sensibilizados se activan las células TH1, que mediante los antígenos especie-específicos liberan TFN. Este contribuye al desencadenamiento de la hipersensibilidad retardada, induciendo en las células endoteliales de los vasos sanguíneos de la dermis la expresión secuencial de moléculas de adherencia selectiva ICAM-I y VCAM-I, que se unen a “sus” receptores de leucocitos, dirigiéndolos hacia la zona de reacción.

A las 4 horas post-inoculación hay una mayoría de neutrófilos en la zona, pero a las 12 horas son mayoritarios los monocitos y los linfocitos T, a las 24 horas se produce una intensa infiltración por estas células mononucleares, variando la presencia de PMNs, según especie; a las 48 horas existe una amplia infiltración linfocitaria alrededor de los vasos sanguíneos, que se extiende hacia afuera y trastorna la organización de las haces de colágeno de la dermis, disminuyendo la proporción de macrófagos entre las 48 y 96 horas, precisamente cuando la reacción se hace máxima. La lesión tiende a regresar, aunque en ocasiones puede convertirse en granulomatosa, dependiendo de la persistencia del antígeno en los tejidos. La medida de esta reacción cutánea (grosores usada como base de la prueba diagnóstica a la TBC (Roitt et al., 1988).

En individuos no sensibilizados no existen linfocitos memoria, capaces de reconocer los antígenos micobacterianos, por lo que no se desencadena la reacción.

Sin embargo existen individuos con TBC activa -TBC miliares- en los que puede existir una menor respuesta ó no haberla (anergia) (Scordomaglia y col.s, 1988). Este denómeno es debido a la falta de respuesta inflamatoria, pues las linfocinas predominantes son las de las TH2; el balance γIFN/IL4, resulta positivo para esta última; como la IL4 también predomina en situaciones de tolerancia inmunológica, la IDRT puede resultar falsamente negativa en animales que, padeciendo una infección por Micobacterium tuberculosis complex, no hayan reaccionado contra ella. En individuos con respuestas deficientes al PPD se ha observado que puede estar relacionado con una reducción de la producción de IL2, y de la expresión de receptores para esta interleucina en las células T (Toosy et al., 1986).

CONSIDERACIONES SOBRE LA IDRT

Los actinomicetos (micobacterias, Nocardia asteroides y Corynebacterium pyogenes) tienen antígenos comunes que posibilitan una respuesta celular cruzada, inespecífica (Chávez y Fernández, 1976; Chávez y Guerra, 1981; Bernardelli et al., 1983-2006; Harboe et al., 1992). En los terrenos de pastoreo y abrevaderos de los animales puede haber micobacterias atípicas, que pueden interferir el diagnóstico por IDRT (Oriani y Sagardoy, 2002-07).

Anergia es el estado en el que los linfocitos CD4+ han perdido su capacidad para reaccionar de manera específica a un antígeno al que estaban sensibilizados antes (Hinshaw, 2005). Entre las causas de anergia, (que interesan en la enfermedad TBC), cabe citar la TBC miliar; otras infecciones o infestaciones menos frecuentes en ganado bovino pueden ocasionalmente causar anergia, como candidiasis y leishmaniosis. Naturalmente también cabe citar la infección por el Pestivirus de la diarrea vírica bovina-enfermedad de las mucosas, que puede originar aplasia de timo, y el IBR, que también es inmunosupresor (las infecciones víricas por un lado bloquean la activación de interferones tipo I, lo que dificulta la eliminación de patógenos intracelulares, como las micobacterias; además la repetida estimulación de los TLRs produce tolerancia (como se describe anteriormente) y también hay que tener en cuenta el probable estado de déficit nutricional a que conllevan al individuo infecciones y parasitosis concomitantes

PRECAUCIONES GENERALES

Se debe suspender o evitar la administración de esteroides sistémicos o fármacos inmunosupresores al menos tres días antes de realizar el procedimiento de IDRT, ya que esos medicamentos pueden influir en los resultados (Nagar et al., 2006).

• Reversión: en humanos, sería un disminución en la induración, comparada con la obtenida en una prueba realizada años antes. (Menzies, 1999)
• Conversión: la prueba es positiva, mientras que tres a seis meses antes fue negativa. Esto puede deberse a la aplicación de BCG (experimentalmente, en animales vacunados) o a una infección posterior a la primera investigación, por micobacterias del complejo tuberculosis o por micobacterias atípicas. (Menzies, 1999).
• Reforzamiento: cuando por la aplicación repetida del antígeno la prueba se vuelve positiva. Esto es debido a la memoria inmunológica sobre la hipersensibilidad retardada preexistente para antígenos de micobacterias (Menzies et al., 1999). Al aplicar el reforzamiento se han realizado pruebas de PPD de dos pasos, que consisten en inocular tuberculina en dos ocasiones, separadas por un intervalo de una a tres semanas, esto permite que la inmunidad celular “recuerde al antígeno” y se produzca una respuesta positiva en los animales que han tenido contacto previo hace largo tiempo con antígenos de micobacterias (tuberculosis, micobacteriosis atípicas, BCG), y habían resultado negativos en el primer examen con PPD (falso negativo). Es importante no frotar, rascar o cubrir el sitio de la aplicación (en animales esto resulta prácticamente imposible de asegurar).

Potencia de la tuberculina PPD:

El PPD se obtiene de la precipitación de un filtrado del cultivo de M. tuberculosis, M. bovis ó M. avium, etc., con sulfato de amonio o ácido tricloroacético. Existen potencias diferentes medidas, según la actividad biológica, en UT (unidades de tuberculina), las de primera potencia corresponden a 1 UT, potencia intermedia de 5 UT y la segunda potencia de 250 UT. (Roswurm y Konhyal 1973; Roswurm et al., 1979). Su uso depende de la sensibilidad de la especie y aún de los individuos (el PPD de primera potencia se utiliza para individuos que se sospecha son altamente sensibles-

Interpretación de la Reacción

• NEGATIVO: engrosamiento del espesor de la piel entre 0 y 2 mm y ausencia de reacción clínica como edema difuso, exudado, necrosis, dolor o reacción inflamatoria de ganglios o canales linfáticos regionales.
• DUDOSO: engrosamiento de piel mayor de 2 y menor de 4 mm y ausencia de signos clínicos
• POSITIVO: un engrosamiento de la piel igual o mayor de 4mm o existencia de signos clínicos

(existe además una interpretación severa y otra extrasevera según ciertas situaciones epidemiológicas )

Si se realiza comparación con el PPD aviar:

• Negativo: Reacción negativa a la tuberculina bovina o reacción positiva o dudosa a la tuberculina bovina pero igual o inferior a una reacción positiva o dudosa a la tuberculina aviar, con ausencia de signos clínicos. 
• Dudoso: Reacción a la tuberculina bovina positiva o dudosa y superior entre 1 a 4 mm a la reacción a la tuberculina aviar, con ausencia de signos clínicos.
• Positivo: Reacción a la tuberculina bovina superior en más de 4 mm a la reacción a la tuberculina aviar o presencia de signos clínicos (Álvarez et al.,2009).

Falsos Positivos.

• Puede estar causada por la exposición a vacunas, como la BCG o incluso contra la Paratuberculosis.
• Más frecuentemente se debe a la exposición a micobacterias atípicas o a otros actinomicetos.

Reacciones Dudosas:

• Puede ser debida a infecciones por micobacterias atípicas, con antígenos homólogos que den respuestas más débiles.
• También está descrita la aparición de la reacción de Jones-Mote tras la inyección de tuberculina; se caracteriza por una acumulación de basófilos y se evidencia por induración local. Se debe a la formación de inmunocomplejos, no es una reacción de inmunidad retardada, y desaparece a los dos días post-inoculación.
• Con el transcurso del tiempo, la sensibilidad tuberculínica se debilita gradualmente, hasta tal punto que puede llegar a ser negativa la prueba de la tuberculina. No obstante, la tuberculina administrada en la prueba cuyo resultado fue negativo puede estimular la sensibilidad tuberculínica debilitada, pero existente, de manera que el resultado de una prueba posterior puede ser positivo e interpretarse, erróneamente, como una conversión tuberculínica. El efecto booster o intensificador puede observarse cuando se realiza una nueva tuberculinización a los 7-8 días después de haberse realizado otra que ha dado resultado negativo: esta vez daría positivo; en definitiva, la sucesiva estimulación de la actividad tuberculínica en un breve espacio de tiempo, trae como resultado que aquélla sea detectable durante períodos de dos años o más.

Falsos Negativos:

Se pueden dar en diferentes circunstancias.

• El debilitamiento de la sensibilidad a la tuberculina por infección tuberculosa, puede hallarse sobre todo en animales viejos. Cuando se repite la prueba por segunda vez a los 7 o 10 días, efecto booster, el resultado se hace positivo por reforzamiento de la respuesta inmune, sin que ello implique una conversión reciente.
• Cuando hay un predominio de la respuesta TH2, con fuerte presencia de IL4 y ausencia de γ-IFN (enfermedad generalizada, anergia).
• Cuando anergia, ocasionada por la exposición sucesiva a antígenos micobacterianos.
• interferencias debidas a las infecciones por el y/o por subsp. paratuberculosis, conjuntamente con . En este tipo de infecciones, aunque se haga la IDRT comparativa, puede no existir reacción mas intensa al PPD aviar (Álvarez et al. 2009), o porque la infección ha sido muy reciente y aún no se ha desarrollado inmunidad retardada.
• Coinfección con virus inmuno supresor (BVD, IBR, HIV, CVPII, etc) y parásitos (Fasciola hepática)
• Terapéutica con antiinflamatorios esteroideos
• Estados de inmunodeficiencia (partos recientes, períodos de convalescencia de enfermedades recientes
• Inmunosupresion por estrés (obliga al organismo a producir elevadas cantidades de cortisol)

 

AGRADECIMIENTOS:

El autor agradece al Pf. D. Javier Hermoso de Mendoza y Salcedo su colaboración en la supervisión de la versión de este texto.

 

Descargar esta publicación: Tuberculosis en mamíferos: Tipo de respuesta inmune: consecuencias. Diagnóstico por IDRT.

Otra publicación en SOCIVESC del autor Ángel Tato Jiménez: La Tuberculosis en mamíferos; ZOONOSIS.  

 

 

BIBLIOGRAFÍA

Álvarez, J., L. de Juan, B. Romero, E. Castellanos, J. Bezos, S. Rodríguez, A. Aranaz, A. Mateos, L. Domínguez. (2009). Epidemiología y diagnóstico de la tuberculosis bovina. Laboratorio de Vigilancia Sanitaria. Laboratorio Vigilancia Sanitaria (VISAVET) Departamento de Sanidad Animal Facultad de Veterinaria Universidad Complutense de Madrid. Www.vigilanciasanitaria.es 

 Anand PK.; Kaul D. (2003) Vitamin D3 dependent pathway regulates TACOgene transcription. Biochem Biophys Res Commun; 310: 876-877

 Baeke F.; Takiishi T.; Korf, H.; Gysemans, C.; Mathieu C. (2010). Vitamin D: modulator of the immune system. Curr Opin Pharmacol; 10: 482-496

Barreda, D.R., P.C. Hanington, and M. Belosevic, Regulation of myeloid development and function by colony stimulating factors.  Dev Comp Immunol, 2004. 28 (5): p. 509-54. 

Bernardelli, A.; Navarro, N.; Kantor, I.N. 1983. Especificidad de algunas sensitinas micobacterianas. Rev. Arg. Tub. Enf. Pulm. Sal. Publ. 44:5-10. 

Bernardelli, A.; Oriani, D. S.; Alonso, B. 2006. Elaboración y prueba de potencia de sensitinas correspondientes a Mycobacterium phlei y Mycobacterium fortuitum aisladas de suelos pampeanos. AAVLD, Mar del Plata. 

Betz M, Fox BS. Prostaglandin E2 inhibits production of Th-1 lymphokines but not of Th-2 lymphokines. J Immunol 1991; 146: 108-13. 

Bleharski JR, Niazi KR, Sieling PA, Cheng G and Modlin RL. 2001. Signaling lymphocytic activation molecule is expressed on CD40 ligand-activated dendritic cells and directly augments production of inflammatory cytokines. J Immunol 167(6): 3174-3181. 

BORSELLINO G, KLEINEWIETFELD M, DI MITRI D, STERNJAK A, DIAMANTINI A, GIOMETTO, R, HOPNER S, CENTONZE D, BERNARDI G,DELL’ACQUA ML, ROSSINI PM, BATTISTINI L, RÖTZSCHKE O, FALK K. 2007. Expression of ectonucleotidase CD39 by Foxp3+ Treg cells: hydrolysis of extracellular ATP and immune suppression. Blood 110:1225-1232. 

Caracciolo, D., et al., Recombinant human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) requires subliminal concentrations of granulocyte/macrophage (GM)-CSF for optimal stimulation of human macrophage colony formation in vitro.  J Exp Med, 1987. 166 (6): p. 1851-60. 

Casillas*, Graham Rook** (2004). INMUNOPATOLOGIA DE LA TUBERCULOSIS  PULMONAR EXPERIMENTAL.  MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXVIII (2004). (http://bq.unam.mx/mensajebioquimico) (ISSN-0188-137X) 

Cell Function. J. Exp. Med. The Rockefeller University Press • 0022-1007/2003/01/7/11 $8.00 Volume 197, Number 1, January 6, 2003 7–17 http://www.jem.org/cgi/doi/10.1084/jem.20021229 

Chatterjee, D., and K.H. Khoo. 1998. Mycobacterial lipoarabinomannan: an extraordinary lipoheteroglycan with profound physiological effects. Glycobiology. 8:113–120. 

Chávez, P. R.; Fernández, A. 1976. Sensibilidad inespecífica a la tuberculina mamífera en los bovinos en Cuba. Rev. Cub. Cienc. Vet. 7:75-82. 

Chávez, P. R.; Guerra, A. 1981. Causas de nuevos reactores a la tuberculina mamífera en un área libre de tuberculosis bovina. Rev. Cub. Cienc. Vet. 12:107-112. 

CHEN W, JIN W, HARDEGEN N, LEI KJ, LI L, MARINOS N, MCGRADY G, WAHL SM. 2003. Conversion of peripheral CD4+CD25- naiveT cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-β induction of transcription factor Foxp3. J Exp Med 198: 1875-1886.

Cocks BG, Chang CC, Carballido JM, Yssel H, de Vries JE and Aversa G. 1995. A novel receptor involved in T-cell activation. Nature 376(6537): 260-263. 

Cohen, M. K., R. A. Bartow, C. L. Mintzer & D. N. McMurray: Effects of diet and genetics on Mycobacterium bovis BCG vaccine efficacy in inbred guinea pigs. Infect. Immun. 55:314-319 (1987)

Conti, L. and S. Gessani, GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.  Immunobiology, 2008. 213 (9-10): p. 859-70. 

 Cooke NE.; Haddad JG. (1989) Vitamin D binding protein (Gc globulin). Endocr Rev; 10: 294-307

Cornstock, G.W. (1994) Control. Clin. Trids 15,247-276

Dai G, Phalen S, McMurray DN. Nutritional modulation of host responses to mycobacteria. Front Biosci. 1998; 3:E110–E122. [PubMed: 9665874]

Deluca H, Cantorna M. Vitamin D: Its role and uses in immunology. FASEB J 2001;15(14):2579-85.

Denis, M.: Killing of M. tuberculosis within human monocytes: activation by cytokines and calcitriol. Clin. Exp. Immunol. 84: 200-206 (1991)

Engering, A., T.B. Geijtenbeek, S.J. van Vliet, M. Wijers, E. van Liempt, N. Demaurex, A. Lanzavecchia, J. Fransen, C.G. Figdor, V. Piguet, and Y. van Kooyk. 2002. The dendritic cell-specific adhesion receptor DC-SIGN internalizes antigen for presentation to T cells. J. Immunol. 168:2118–2126. 

 Ernst JD. Macrophage receptors for Mycobacterium tuberculosis. Minireview. Infect Immun 1998;66:1277-1281

F. ROMERO-PALOMO, P.J. SÁNCHEZ CORDÓN, M.A. RISALDE, M. PEDRERA, V. MOLINA, E. RUIZ-VILLAMOR, J.C. GÓMEZ-VILLAMANO (2011). FUNCIONES Y CLASIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS. ANALES - VOL. 24 (1) - DIC. 2011 - REAL ACADEMIA DE CIENCIAS VETERINARIAS DE ANDALUCÍA ORIENTAL 

Fenhalls G, Stevens L, Moses L, Bezuidenhout J, Betts JC, van Helden P, et al. In situ detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infections and Immunity 2002; 70(11):6330-8. 

GARIN MI, CHU CC, GOLSHAYAN D, CERNUDAMOROLLON E, WAIT R, LECHLER RI. 2007. Galectin-1: a key effector of regulation mediated by CD4+CD25+ T cells. Blood 109: 2058-2065 

GLIMCHER LH, MURPHY KM. 2000. Lineage commitment in the immune system: The T helper lymphocyte grows up. Genes Dev 14: 1693-1711. 

Goldstein DB, Pollock DD. Launching microsatellites: a review of mutation processes and methods of phylogenetic inference. Journal of Heredity. 1997; 88:335. 

Gómez M, Doukhan L, Nair G, Smith I. sigA is an essential gene in Mycobacterium smegmatis. Mol Microbiol 1998; 29:617-28. 

 Gringhuis,SI Jeroen den Dunnen, Manja Litjens, Bert van het Hof, Yvette van Kooyk, and Teunis B.H. Geijtenbeek (2007). C-Type Lectin DC-SIGN Modulates Toll-like Receptor Signaling via Raf-1 Kinase-Dependent Acetylation of Transcription Factor NF-kB. Immunity 26, 605–616, May 2007

Hampshire T, Soneji S, Bacon J, James BW, Hinds J, Laing K, et al. Stationary phase gene expression of Mycobacterium tuberculosis following a progressive nutrient depletion: a model for persistent organisms? Tuberculosis 2004; 84:228-38. 

Harboe, M.; Wiker, H.; Nagai, S. 1992. Protein Antigens of Mycobacteria Studied by Quantitative Inmunologic Techniques. Clin. Infect. Dis. 14:313-319. 

 Havlir DV, Ellner JJ, Chervenak KA, Boom WH. Selective expansion of human ãä T cells by monocytes infected with live Mycobacterium tuberculosis. J Clin Invest 1991;87:729-33.

Hernández-Pando R, Jeyanathan M, Mengistu G, Aguilar D, Orozco H, Harboe M, Rook GA, et al. Persistence of DNA from Mycobacterium tuberculosis in superficially normal lung tissue during latent infection. Lancet 2000;356:2133-8. 

 Hewison M.; Zehnder D.; Chakraverty R.; Adams JS. (2004) Vitamin D and barrier function: a novel role for extra-renal 1 alpha-Hydroxylase. Mol Cell Endocrinol; 215: 31-38

Hinshaw W. Hypersensitivity reactions delayed. E-medicine, 2005 (http://www.emedicine.com/MED/topic1100.htm) 

Honer zu BK, Russell DG. Mycobacterial persistence: adaptation to a changing environment. Trends Microbiol 2001; 9:597-605. 

Hu Y, Mangan JA, Dhillon J, Sole KM, Mitchison DA, Butcher PD, Crates AR. Detection of mRNA transcripts and active transcription in persistent Mycobacterium tuberculosis induced by exposure to rifampin or pyrazinamide. J Bacteriol 2000;182:6358-65. 

Hutloff A, Dittrich AM, Beier KC, Eljaschewitsch B, Kraft R, Anagnostopoulos I and Kroczek RA. 1999. ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28. Nature 397(6716): 263-266. 

 Judd SE.; Tangpricha V. (2009) Vitamin D deficiency and risk for cardiovascular disease. Am J. Med Sci; 338: 40-44

KANG SG, LIM HW, ANDRISANI OM, BROXMEYER HE, KIM CH. 2007. Vitamin A Metabolites Induce Gut-Homing FoxP3 Regulatory T Cells. J Immunol 179: 3724-3733. 

Keusch, T. G. 1993. Malnutrition and the thymus gland, p. 283–299. In T. G. Keusch and R. S. Cunningham (ed.), Nutrient modulation of the immune response. Marcel Dekkar, Inc., New York, N.Y.

KIM CH. 2006. Migration and function of FoxP3+regulatory T cells in the hematolymphoid system. Exp Hematol 34: 1033-1040.

Kubach, J., et al., Dendritic cells: sentinels of immunity and tolerance.  Int J Hematol, 2005. 81 (3): p. 197-203. 

Kuroda E, Suguira T, Zeki K, Yoshida Y, Yamashita U. Sensitivity difference to the suppressive effect of prostaglandin E2 among mouse strains: a possible mechanism to polarize Th2 type response in BALB/c mice. J Immunol 2000; 164: 2386-95. 

L.G. Adams and J.W. Templeton, Genetic resistance to bacterial diseases of animals, Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.,1998, 

Li, G., Y.J. Kim, and H.E. Broxmeyer, Macrophage colony-stimulating factor drives cord blood monocyte differentiation into IL-10(high)IL-12absent dendritic cells with tolerogenic potential.  JImmunol, 2005. 174 (8): p. 4706-17. 

LIANG B, WORKMAN C, LEE J, CHEW C, DALE BM, COLONNA L, FLORES M, LI N, SCHWEIGHOFFER E, GREENBERG S, TYBULEWICZ V, VIGNALI D, CLYNES R. 2008. Regulatory T cells inhibit dendritic cells by lymphocyte activation gene-3 engagement of MHC class II. J Immunol 180: 5916-5926.

Lin R, White JH. The pleiotropic actions of vitamin D. BioEssays 2004;26:21-8

LOCKSLEY RM. 2009. Nine lives: Plasticity among T helper cell subsets. J Exp Med 206: 1643-1646. 

Ma DY, Clark EA. The role of CD40 and CD154/CD40L in dendritic cells. Semin. Immunol. 21: 265-72 (2009).

Mainali, E. S. & D. N. McMurray: Protein deficiency induces alterations in the distribution of T cell subsets in experimental pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 66:927-931 (1998)

Manganelli R, Voskuil MI, Schoolnik GK, Dubnau E, Gomez M, Smith I. Role of the extracytoplasmic-function sigma factor sigma(H) in Mycobacterium tuberculosis global gene expresión. Mol Microbiol 2002; 45:365-74. 

McKinney JD, Honer zu BK, Munoz-Elias EJ, Miczak A, Chen B, Chan WT, et al. Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyasa. Nature 2000; 406:735-8.

McMurray, D. N., C. L. Mintzer, R. A. Bartow & R. L. Parr: Dietary protein deficiency and Mycobacterium bovis BCG affect interleukin-2 activity in experimental pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 57: 2606-2611 (1989)

McMurray, D. N., R. A. Bartow, C. L. Mintzer & E. Hernandez-Frontera: Micronutrient status and immune function in tuberculosis. Ann Acad Sci, NY, 587:59-69 (1990)

 Means TK, Wang S, Lien E, Yoshimura A, Golenbock DT and Fenton MJ. Human toll-like receptors mediate cellular activation by Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol 1999; 163: 3920.3927

 Medvedev AE., I. Sabroe, J. D. Hasday, S. N. Vogel, J. Endotoxin Res. 12, 133 (2006).

 Medzhitov R, Preston-hurlburt P, and Janeway  CA. A human homologue of the drosophyla toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 1997; 388: 394-397

MELLOR AL, MUNN DH. 2004. IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism. Nat Rev Immunol 4: 762-774. 

Menzies D. Interpretation of repeated tuberculin tests boosting, conversion, and reversion. Am J Respir Crit Care Med 1999;159:15-21. 

Milano S, Arcoleo F, Dieli M, D’Agostino R, D’Agostino P, De Nucci G and Cillari E. Prostaglandin E2 regulates inducible nitric oxide synthase in the murine macrophage cell line J774. Prostaglandins 1995; 49: 105-15 

Minagawa H, Tanaka K, Ono N, Tatsuo H and Yanagi Y. 2001. Induction of the measles virus receptor SLAM (CD150) on monocytes. J Gen Virol 82(Pt 12): 2913-2917. 

Minjian Chen,  Maziar Divangahi, Huixian Gan, Daniel S.J. Shin, Song Hong,  David M. Lee, Charles N. Serhan, Samuel M. Behar, and Heinz G. Remold (2008) Lipid mediators in innate immunity against tuberculosis: opposing roles of PGE 2 and LXA 4 in the induction of macrophage death. J. Exp. Med. Vol. 205 No. 12 2791-2801 www.jem.org/cgi/doi/10.1084/jem.20080767. 

Munk, ME; Mayer, P.; Anding, P.; Feldmann, K.; Haufman, SH. (1996). Increased numbers of Interleukin-12-producing cell in human tuberculosis. Infect, Immun, 64; Pp:1708-180 

Nadine Álvarez, Reinier Borrero, Fátima Reyes, Frank Camacho, Norazmi Mohd, María Elena  Sarmiento, Armando Acosta. (2009). Mecanismos de evasión y persistencia de Mycobacterium tuberculosis durante el estado de latencia y posibles estrategias para el control de la infección latente. VacciMonitor 2009; Vol. 18 No. 3 

Nagar R, Pande S, Khopkar U. Intradermal tests in dermatology-I: Tests for infectious diseases. Ind J Dermatol Venereol Leprol 2006;72:461-64. 

 Oddo M, Renno T, Attinger A, Bakker T, MacDonald HR and Meylan PR. Fas ligand induced apoptosis of infected human macrophages reduces the viability of intracellular Mycobacterium tuberculosis. J. immunol. 1998; 160: 5448-5454

Orabona C, Grohmann U, Belladonna ML, Fallarino F, Vacca C, Bianchi R, Bozza S, Volpi C, Salomon BL, Fioretti  MC, Romani L, Puccetti P. CD28 induces immunostimulatory signals in dendritic cells via CD80 and CD86. Nat Immunol. 5: 1134-42 (2004). 

Oriani, D. S.; Sagardoy, M. A. 2002. Nontuberculous mycobacteria in soils of La Pampa province (Argentina). Rev. Arg. Microbiol. 34:132-137. 

Oriani, D. S.; Sagardoy, M. A. 2007. Lesiones en Mus musculus inoculados con Mycobacterium phlei, Mycobacterium kansasii y Mycobacterium fortuitum aislados de suelos pampeanos (República Argentina). In Vet. 9(1):43-51. 

Park HD, Guinn KM, Harrell MI, Liao R, Voskuil MI, Tompa M, et al. Rv3133c/ dosR is a transcription factor that mediates the hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol 2003;48:833–43. 

Parrish NM, Dick JD, Bishai WR. Mechanisms of latency in Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol 1998; 6(3):107-12. 

PERRUCHE S, ZHANG P, LIU Y, SAAS P, BLUESTONE JA, CHEN W. 2008. CD3-specific antibodyinduced immune tolerance involves transforming growth factor-β from phagocytes digesting apoptotic T cells. Nat. Med. 14: 528-535. 

 Peterlik M.; Boonem S.; Cross HS.;Lamberg-Allardrt C. (2009) Vitamin D and calcium insufficiency-related chronic diseases: an emerging world-wide public health problem. Int J Environ Res public Health; 6: 2585-2607

 Pilz S.; Tomaschitz A.; Obermayer-Pietsch B.; Dobning H.; Pieber TR. (2009). Epidemiology of vitamin D insufficiency and cancer mortality. Anticancer Res; 29: 3699-3704

Primm TP, Andersen SJ, Mizrahi V, Avarbock D, Rubin H, Barry CE. The stringent response of Mycobacterium tuberculosis is required for long term survival. J Bacteriol 2000;182:4889-98. 

Qureshi T., Templeton J.W. and Adams L.G. Intracellular survival of Brucella abortus, Mycobacterium bovis (BCG), Salmonella dublin and Salmonella typhimurium in macrophages from cattle genetically resistant to Brucella abortus. Vet. Immunol. Immuno-pathol., 1996, 50, 55-66.) 

Radostist, D.; Blood, D.; Gay, C. 1998. Veterinary Medicine. 8ª. Ed. Ed Bailliere Tindal. London UK.1763 p. 

Reis e Sousa C. Dendritic cells in a mature age. Nat Rev Immunol. 6: 476-83 (2006). 

Risco D, Salguero FJ, Cerrato R, Gutierrez-Merino J, Lanham-New S, Barquero-Pérez O, Hermoso de Mendoza J, Fernández-Llario P. (2016). Association between vitamin D supplementation and severity of tuberculosis in wild boar and red deer. Res Vet Sci. 2016 Oct;108:116-9. doi: 10.1016/j.rvsc.2016.08.003. Epub 2016 Aug 24

Roberts DM, Liao RP, Wisedchaisri G, Hol WG, Sherman DR. Two sensor kinases contribute to the hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. J Biol Chem 2004;279:23082–7. 

Rogelio Hernández Pando, Héctor Orozco E, Diana Aguilar L, Fernando López

 Rook, G. A. W., J. Steele, L. Fraher, S. Barker, R. Karmali, J. O’Riordan & J. Stanford: Vitamin D3, gamma interferon, and control of proliferation of M. tuberculosis by human monocytes. Immunol. 57:159-163 (1986)

Rook, G. A. W., J. Taverne, C. Leveton & J. Steele: The role of gamma interferon, vitamin D3 metabolites and tumor necrosis factor in the pathogenesis of tuberculosis. Immunol. 62:229-234 (1987)

Rook, G. A. W., J. W. Carswell & J. L. Stanford: Preliminary evidence for the trapping of antigen specific lymphocytes in the lymphoid tissues of anergic tuberculosis patients. Clin. Exp. Immunol. 26:129-137 (1976)

 Rook, GA.; Steele J.; Fraher L. et ál. (1986) gamma interferon, and control and control of proliferation of Mycobacterium tuberculosis by human monocytes. Immunology; 57: 159-163

ROSWURM J . D . & KONYHA L . D . (1973). - The comparative cervical tuberculin test as an aid to diagnosing bovine tuberculosis. Proc. U.S. Anim. Hlth Ass., 77, 368-369. 

ROSWURM J . D . , KANTOR I.N. DE, MARCHEVSKY N., SPINELLI K. & SPATH E . (1979). -Sensibilidad de las pruebas tuberculínicas en ganado bovino en Argentina.

Rougier, N., D. Schmitt, and C. Vincent, IL-4 addition during differentiation of CD34 progenitors delays maturation of dendritic cells while promoting their survival.  Eur J Cell Biol, 1998. 75 (3): p.287-93. 

 Ruaidhrí J. Carmody, Qingguo Ruan, Scott Palmer, Brendan Hilliard, Youhai H. Chen (2007). Negative Regulation of Toll-Like Receptor Signaling by NF-kB p50 Ubiquitination Blockade. www.sciencemag.org SCIENCE VOL 317 3 AUGUST 2007.

Sallusto, F. and A. Lanzavecchia, Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.  J Exp Med, 1994. 179 (4): p.1109-18. 

 Sastry K, Ezekowitz RA. Collectins: pattern recognition molecules involved in first line host defense. Curr Opin Immunol 1993;5:59-66.

Schlesinger, L.S. 1993. Macrophage phagocytosis of virulent but not attenuated strains of Mycobacterium tuberculosis is mediated by mannose receptors in addition to complement receptors. J. Immunol. 150:2920–2930. 

Schlesinger, L.S., S.R. Hull, and T.M. Kaufman. 1994. Binding of the terminal mannosyl units of lipoarabinomannan from a virulent strain of Mycobacterium tuberculosis to human macrophages. J. Immunol. 152:4070–4079. 

Schnappinger D, Ehrt S, Voskuil MI, Liu Y, Mangan JA, Monahan IM, et al. Transcriptional adaptation of Mycobacterium tuberculosis within macrofages: insights into the phagosomal environment. J Exp Med 2003; 198:369-704. 

Seiler P, Ulrichs T, Bandermann S, Pradl, Jorg S, Krenn V, Morawietz L, Kaufmann SHE Aichele P. Cell-wall alterations as an attribute of Mycobacterium tuberculosis in latent infections. JID 2003;188:1326-31. 

Sharma D, Bose A, Shakila H, Das TK, Tyagi JS, Ramanathan VD. Expression of mycobacterial cell division protein, FtsZ, and dormancy proteins, DevR and Acr, within lung granulomas throughout guinea pig infection. FEMS Immunol Med Microbiol 2006; 48:329–36. 

Stahl EA, Raychaudhuri S, Remmers EF, Xie G, Eyre S, Thomson BP, et al. Genomewide association study meta-analysis identifies seven new rheumatoid arthritis risk loci. Nat Genet. 2010;42:508–14 

Stewart GR, Robertson BD, Young DB. Tuberculosis: a problem with persistence. Nat Rev Microbiol 2003; 1(2):97-105. 

Sturgill-Koszycki, S., P.H. Schlesinger, P. Chakraborty, P.L. Haddix, H.L. Collins, A.K. Fok, R.D. Allen, S.L. Gluck, J. Heuser, and D.G. Russell. 1994. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263:678–681. 

Taha, RA.; Eleanor, M.; Minshal, M.; Olivennstein, R.; Ihaku, D.; Wallaert, B.; Tsicopoulus, A.; Tonnel, AB.; Damia, R.; Menzeis, D.; Hamid, QA. (1999) Increased expression of IL12 receptor mRNA in active pulmonary tuberculosis and sarcoidiosis, Am J Respir Crit Care Med. 160;  Pp: 1119-1123 

Talaat AM, Ward SK, Wu CW, Rondon E, Tavano C, Bannantine JP, et al. Mycobacterial bacilli are metabolically active during chronic tuberculosis in murine lungs: insights from genomewide transcriptional profiling. J Bacteriol 2007; 189:4265-74. 

Teunis B.H. Geijtenbeek, Sandra J. van Vliet, Estella A. Koppel, Marta Sanchez-Hernandez, Christine M.J.E. Vandenbroucke-Grauls, Ben Appelmelk, and Yvette van Kooyk (2002). Mycobacteria Target DC-SIGN to Suppress Dendritic 

Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 3: 133-46 (2003) 

Verreck, F.A., et al., Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.  Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101 (13): p. 4560-5. 

Verreck, F.A., et al., Phenotypic and functional profiling of human proinflammatory type-1 and anti-inflammatory type-2  macrophages in response to microbial antigens and IFN-gamma- and CD40L-mediated costimulation.  J Leukoc Biol, 2006. 79 (2): p. 285-93. 

 Wang TT.; Tavera-Mendoza LE.; Lapierre D. et ál. (2005)Large-scale in silico and microarray-based identification of direct 1,25 dihydroxyvitamin D3target genes. Mol Endocrinol; 19: 2685-2695

 White JH. (2008) Vitamin D signaling, infectious diseases, and regulation of innate immunity. Infect Immun; 76: 3837-3843

 White JH. (2010) Vitamin D as an inducer cathelicidin antimicrobial peptide expression: past, present and future. J steroid Biochem Mol Biol; 121: 234-238

 Woodward, B. D. & R. G. Miller: Depression of thymus dependent immunity in wasting protein energy malnutrition does not depend on an altered ratio of helper (CD4) to suppressor (CD8) T cells or on a disproportionately large atrophy of the T cell relative to the B-cell pool. Am. J. Clin. Nutr. 53:1329-1334 (1991)

Wu H, Cheng D, Wang L. Association of polymorphisms of Nramp1 gene with immune function and production performance of Large White pig. J Genet Genomics. 2008;35:91–95. 

Xiaoling Ding, Xiaodong Zhang, Yong Yang, Yueyun Ding, Weiwei Xue, Yun Meng, Weihua Zhu, and Zongjun Yin* (2014). Polymorphism, Expression of Natural Resistance-associated Macrophage Protein 1 Encoding Gene (NRAMP1) and Its Association with Immune Traits in Pigs.  Asian Australas. J. Anim. Sci. Vol. 27, No. 8 : 1189-1195 August 2014 http://dx.doi.org/10.5713/ajas.2014.14017 

 Xu H.; Soruri A.; Gieseler, RK.; Peters, JH. (1993) 1,25Dihydroxivitamin D3 exerts opposing effects to IL-4 on MHC clas-II antigen expression, accesory activity, and phagocytosis of human monocytes. Scand J. Immunol; 38: 535-540

Xu, S., A. Cooper, S. Sturgill-Koszycki, T. van Heyningen, D. Chatterjee, I. Orme, P. Allen, and D.G. Russell. 1994. Intracellular trafficking in Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium-infected macrophages. J. Immunol. 153:2568–2578. 

Yuan Y, Crane DD, Barry CE. Stationary phase-associated protein expression in Mycobacterium tuberculosis of the mycobacterial á-crystallin homolog. J Bacteriol 1996;178:4484-92. 

Yuan Y, Crane DD, Simpson RM, Zhu YQ, Hickey MJ, Sherman DR and Barry CE. The 16-kDa á-crystallin (Acr) Protein of Mycobacterium tuberculosis is required for the growth in macrophages. Proc NATL Acad Sci USA 1998;95:9578-83. 

 Zanetti M. (2004) Cathelicidins , multifunctional peptides of the innate immunity. J Leukoc Biol; 75: 39-48

ZHU J, PAUL WE. 2008. CD4 T cells: Fates, functions, and faults. Blood 112: 1557-1569. 

ZIEGLER SF. 2006. FOXP3: of mice and men. Annu Rev Immunol 24: 209-226. 

Zou, W., et al., Macrophage-derived dendritic cells have strong Th1-polarizing potential mediated by beta-chemokines rather than IL-12.  J Immunol, 2000. 165 (8): p. 4388-96.